植物内生芽孢杆菌的研究进展

论文作者

龚国利,王亮,王旭阳,张帝,吴咪,田露
(陕西科技大学食品与生物工程学院,西安710021)

芽孢杆菌科是一类好氧性产芽孢的革兰氏阳性杆状细菌,其生理特征丰富多样,分布广泛,极易分离培养,是植物内生菌里研究最多以及应用价值广泛的一大类细菌。芽孢杆菌作为植物微生物内生态的组成部分,占据了有利的生态位并广泛地定殖于植物体内。其为植物提供了相应的益处,包括促进植物生长,在植物病原微生物、昆虫和线虫入侵过程产生拮抗,以及与植物联合修复环境,提高宿主植物抗逆性等。多数内生芽孢杆菌的代谢产物还具有多种生理活性,是应用前景广泛的微生物资源宝库。其具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力,可在农作物生防、天然药物研发、环境修复等方面发挥重要作用。因此,对植物内生芽孢杆菌的研究具有重要的理论意义及应用价值。本文对近年来植物内生芽孢杆菌的多样性、对宿主植物的功能作用、应用及总结展望等方面进行综述。

1　植物内生芽孢杆菌的多样性

植物体内的芽孢杆菌资源极其丰富,广泛分布于植物的根茎花叶果实和种子,并且宿主植物和芽孢杆菌的种类繁多,是植物内生芽孢杆菌物种多样性的表现。其中枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)为其中的优势种。芽孢杆菌属(Bacillus)、类芽孢杆菌属(Paemibacillus)和短芽孢杆菌属(Breuibacillus)等菌属的相关报道较多。葛慈斌等从武夷山自然保护区采集了9种地衣标本,共分离出34种内生菌,表明了地衣中芽孢杆菌的物质多样性;其中类芽孢杆菌和芽孢杆菌作为优势属,分别占总分离细菌的41．2%和35．3%。

目前芽孢杆菌多样性的研究采用传统的分离培养法,分离得到纯培养物后通过形态学和分子生物学手段鉴定种属。Sharma等通过传统的分离培养法从藏红花植物中分离出54株内生细菌,利用分子和系统发育分析将其分为11个不同的类群,其中芽孢杆菌属有地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)、胡米芽孢杆菌(Bacillushumi)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)和沙福芽孢杆菌(Bacillussafensis)等。由于传统分离培养法会丧失不可培养的细菌,且内生微生物群的复杂性会产生不准确的生态结果。而非培养法具有可克服传统培养法的诸多缺点,因此,近些年来发展迅速。Goulart等使用Illumina测序法对西番莲相关的内生细菌群落进行了统计,在属水平上芽孢杆菌的数量最多,约占12．9%。培养法和非培养法都具有其独特的优点和缺点,这两种方法的组合使用可以提供更好的策略来研究芽孢杆菌的多样性。

2　植物内生芽孢杆菌对宿主植物的作用

2．1　促生长

大量文献报道,芽孢杆菌的定殖可以促进植物生长。多数芽孢杆菌可以通过产生或诱导活性代谢产物和促进无机物吸收来调节植物的生长发育,包括促进种子萌发、提高幼苗存活率以及根茎叶的生物量等。Zhao等从药用植物忍冬中分离到被鉴定为芽孢杆菌属的6株内生菌菌株均表现出较强的促进小麦生长的能力,小麦幼苗的株高、根长、鲜重、干重和叶绿素含量均显著增加。Jayakumar等报道了从姜黄(Curcumalonga)根茎中分离的内生芽孢杆菌Fc11具有较强促进植物生长的作用。

内生芽孢杆菌促进植物生长可以通过多种机制介导。一方面,芽孢杆菌可以通过直接产生吲哚乙酸(IAA)、赤霉素(GA)和细胞激动素(KT)等生长激素促进植物生长。Soares等从常春藤中分离出的解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)C6c,研究发现C6c可以通过分泌IAA促进常春藤的生长。此外芽孢杆菌还可以诱导宿主植物自身分泌相应激素,增强系统免疫性来促进植物生长。Raheem等从水稻种子中分离出的解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)RWL-1,其自身可分泌GA,同时也可以诱导水稻内源性激素的水平,结果表明RWL-1在水稻根部定殖并改善植株生长状况,具有替代化肥,提高作物产量的潜力。

另一方面,芽孢杆菌具有溶解磷酸盐和生物固定氮等作用,宿主植物无需产生特化结构就可增加氮和磷等营养元素的吸收。Wang等报道了在盐胁迫条件下弯曲芽孢杆菌(Bacillusflexus)KLBMP4941表现出固氮、产生铁载体、氨和促进寄主生长的特性,并在其基因组中发现了与固氮、铁载体、亚精胺和丙酮合成等植物生长促进(PGP)相关的基因。Ribeiro等研究了4株内生芽孢杆菌B1920、B1923、B2084和B2088在体外溶解磷酸铁(Fe-P),产生铁载体和IAA的能力。结果表明所有菌株均溶解Fe-P,其中B1923、B2084和B2088在色氨酸存在下可以产羧酸盐型铁载体和高水平的IAA,未添加磷的条件下植株的地上和地下干重,以及根中N、P、K含量均上升。

此外,内生芽孢杆菌不仅可以通过产生不依赖生长素、乙烯或茉莉酸信号通路的挥发性有机化合物,还可以通过改变酶的活性来促进植物生长,如植物体内SOD、POD和CAT酶等。

2．2　抗病原菌

内生细菌在植物体内长期稳定定殖,通过占据有利生态位与病原菌竞争营养及空间,除此之外还可以产生抗菌物质及水解酶类起到拮抗病原菌作用。内生芽孢杆菌具有广泛的抗菌作用,其抗菌机制包括竞争作用、拮抗作用、诱导植物抗性和多种作用混合等。由于近年来从内生芽孢杆菌中发现了大量具有抗菌活性的天然产物,直接拮抗机制在文献中报道也较为广泛。大量文献报道了内生芽孢杆菌分泌的一系列抗菌物质,包括非核糖体肽合成酶系(NRPSs)合成的脂肽及多肽类物质;核糖体途径合成的细菌素、类细菌素、水解酶类及其他活性蛋白;还有聚酮合酶途径(PKS)合成的聚酮类化合物及其他挥发性有机化合物等。

其中脂肽结构多样,功能多元,具有广泛的抑菌谱及较好的抑菌效果。包括伊枯草菌素(iturins)、杆菌霉素(bacillomycin)、丰原素(fengycins)和表面活性素(surfactin)等家族。Imen等分离出的解淀杆菌芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)CEIZ-11具有广谱抗植物病原真菌活性,通过LC-MS分析检测到3个脂肽家族,包括3个iturinA(A2,A3-5和A6)同源物,一个fengycinA(C16)和一个surfactin(C12)。Gond等从不同品种玉米种子分离到的芽孢杆菌中检测出抗真菌iturinA,fengycin和bacillomycin的存在,并发现其可以诱导宿主植物中防御基因的表达。

内生芽孢杆菌还可以通过产生或诱导宿主植物产生蛋白多肽类抗菌物质,如细菌素、水解酶类和其他抗菌蛋白等抑制病原体。病原真菌的细胞壁组分中含有几丁质和β-1,3-葡聚糖,几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶等物质具有降解病原真菌细胞壁的能力,从而抑制病原真菌生长及相应疾病的发生。Seo等发现苏云金芽孢杆菌GS1产生的几丁质酶使真菌RhizoctoniasolaniKACC40111的菌丝发生降解,从而显著抑制了黄瓜幼苗猝倒的发生率。Habbu等从药用植物黄姜(Dioscoreazingiberensis)中分离的枯草芽孢杆菌(B.subtilis)SWB8分泌的β-1,3-1,4-葡聚糖酶具有广谱的抑菌活性。本实验室分离的短短芽孢杆菌(Brevibacillusbrevis)可产生蛋白类抑菌物质,耐高温、耐碱性物质、对胰蛋白酶和胃蛋白酶不敏感,对革兰氏阴性菌及阳性菌均有良好的抑制效果[16-17]。

除此之外,内生芽孢杆菌还可以产具有抗菌作用的挥发性有机化合物。Estibaliz等从苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)中分离到的双酮哌嗪类化合物,具有抗真菌活性。Vibhuti等从黑胡椒根中分离出的巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)BP17,结果表明该菌株产生的挥发性的吡嗪类化学物对辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)、玉米穗腐病菌(Gibberellamoniliformis)和大叶黄杨炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)等植物病原菌具有拮抗作用。

2．3　抗虫害

植物寄生线虫是导致植物病害的病原体,主要包括大豆胞囊线虫、根结线虫和松材线虫等。由于化学杀虫剂存在高毒性和高残留等弊端,随着民众环保安全意识的提升,寻求一种安全高效以及对环境无污染的新型杀虫剂成了共识,而使用微生物及其天然产物开发生物安全型杀虫剂是具有理论基础可实现性的一条途径。

近年来从土壤中分离得到的具有杀虫作用的细菌数量逐渐下降,植物内生菌这一新型微生物农药资源的开发已成为新的趋势。内生菌长期定殖于植物体内,已经进化为对宿主植物基本无害的物种,普遍具有环境安全性。其中芽孢杆菌因具有长期稳定定殖的能力,且有文献报道其部分菌株具有优良的杀虫特性而受到了一定关注。Rashid等报道了拟南芥幼苗在内生贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)YC7010处理植物根系后,可诱导植株对桃蚜(Myzuspersicae)产生抗性。Hu等从植物组织中分离出的内生蜡状芽孢杆菌BCM2,它能稳定定殖于番茄并具有杀南方根结线虫第二期幼体(J2)的活性。并且该菌株具有促进植物生长,成功占领生态位并具有诱导产生南方根结线虫J2驱避剂的潜力。陈泽斌等筛选出5株具有明显杀全齿复活线虫(Panagrellusredivivus)的细菌,其中4株为解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens),1株为苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)。这5株细菌的发酵液稀释5倍处理线虫12h后,线虫的死亡率均达90%以上;24h后,死亡线虫虫体发生消解或渗漏。

2．4　抗逆境

植物生长发育过程中,面临的逆境分为生物胁迫和非生物胁迫两种。内生芽孢杆菌面临的生物胁迫为病原真菌及寄生线虫,非生物胁迫包括高温、干旱、盐碱和重金属污染。内生芽孢杆菌通过提高其自身及宿主的耐受性应对非生物和生物胁迫,相关报道表明从生长在逆境的植物分离出的许多内生芽孢杆菌都具有抗逆或提高宿主抗逆性的能力。

随着干旱地区、盐碱地及重金属污染土壤等地区面积不断扩大,使得处于逆境下的植物生长及农作物增产愈发困难。因此,研究植物内生生态中稳定定殖的芽孢杆菌为提高宿主植物应对非生物胁迫能力和农作物增产方面提供了新的研究思路。庞海东等分离到8株具有促生作用的芽孢杆菌,这些芽孢杆菌都具有产铁载体、IAA、多糖和淀粉酶活性,且具有抗Cd、Pb、Cu和Zn多种重金属的作用,其中巨大芽孢杆菌(B.megaterium)P24和P37使得香蒲的地上和地下部干重显著增加40．0%~46．4%,表明在重金属污染条件下耐重金属芽孢杆菌能够促进香蒲生长。Gagné-Bourque等研究了在干旱胁迫下接种枯草芽孢杆菌(B.subtilis)B26菌株后对毛茛属植物(PhleumpratenseL.)的生长、含水量、光合作用和代谢的影响。结果表明枯草芽孢杆菌B26可以通过改变根和芽中渗透物的积累来改善干旱胁迫下植株的生长。Chinnaswamy等发现内生巨大芽孢杆菌(B.megaterium)NMp082在体外产生的IAA和1-氨基环丙烷-1-羧酸酯(ACC)脱氨酶,可以促进苜蓿和拟南芥生长且诱导植物的盐胁迫耐受性增强。

3　植物内生芽孢杆菌应用

3．1　农业生防

环境条件、农作物的品种品质和病虫害等都会对作物产量有一定的影响,因此如何获得稳定高产的农作物是目前农业面临的一个难题。芽孢杆菌的特殊性是其可以产生耐热抗逆的芽孢,具有抗逆性强和稳定定殖的优势。由其衍生的微生物农药与传统的化学农药相比,具有对人畜安全无毒害、对环境无污染和对病原菌具有广谱抑制作用且不易产生抗药性的优点,同时具有促生、抗病虫害和抗逆等作用。因此,芽孢杆菌衍生的微生物农药有望成为化学农药的替代品,为稳步提高作物产量提供了可行思路。苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)、蜡样芽孢杆菌(B.cereus)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)是用于农业的研究最多的芽孢杆菌物种。

Ansary等评估了解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)BDR-2和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)BRtL-2两株内生菌,发现两株菌对植物病原真菌核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)均具有拮抗能力,并且可以促进黄瓜和水稻幼苗的生长。Wang等报道了一株具有防治花生青枯病潜力的解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)BZ6-1,其抗菌物质为surfactin和fengycinA等脂肽同系物。采用盆栽试验来检验BZ6-1对花生青枯病的控制效率,每株幼苗添加15mL(108cfu/mL)培养液,发病率从对照的84．5%显著下降到12．1%。

有文献报道内生解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)CC09是应用潜力巨大的一株生防菌,其通过产生Iturin等环脂肽类物质拮抗病原菌,我国科研人员据此开发了两种防治小麦白粉病的解淀粉芽孢杆菌制剂,即以细胞为主体的解淀粉芽孢杆菌可湿性粉剂(≥100亿芽孢/g)和抗真菌成分IturinA为主体的15%水剂。

3．2　医药

植物内生菌是天然药物的重要来源,在其与宿主长期共存中,产生了一系列有活性的代谢产物,如抗菌活性成分、抗病毒物质和抗肿瘤物质等。芽孢杆菌在医药及基因工程领域也有广泛的应用前景,不仅可以生产具有多种功能的活性物质,还拥有作为优良基因工程菌株的潜力,为开发新型药物提供了新的筛选来源。

近年来随着抗生素滥用,耐药菌株甚至超级细菌的出现,更多研究者寄希望于从自然界寻找结构新颖、高效低毒和不易产生耐药性的抗菌活性物质。Moustafa等分离到的芽孢杆菌菌株SA产生的抗菌蛋白,对革兰氏阳性菌具有广谱的抑菌活性,特别是可以抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcusaureus,MRSA)。Akinsanya等从芦荟植物中分离的芽孢杆菌ALR-2产生的活性物质SF5(5mg/mL),能有效抑制蜡样芽孢杆菌(B.cereus)和金黄色葡萄球菌,抑菌圈直径分别为(28．6±0．5)mm和(30．3±0．5)mm,其效果显著高于标准抗生素环丙沙星(5μg,分别为23．6mm±0．5mm和18．6mm±0．5mm)和卡那霉素(30μg,分别为20．3mm±0．5mm和13．6mm±0．5mm)。此外将抗菌物质与金属材料形成复合抗菌材料也是一个新兴的复合领域,有报道将内生芽孢杆菌产生的抗菌脂肽用于合成银纳米粒子(Ag-NPs)[33-34],其不仅具有极强的稳定性,还对多种致病菌具有敏感性。

此外,随着人口老龄化的日益严重,肿瘤患者逐渐增多。直接从药用植物中提取抗肿瘤物质是一直以来最为常见的抗肿瘤药物来源,但存在植物中的抗肿瘤物质含量少和提取率低的问题。而采用化学方法合成药物,同样存在毒性大的弊端。因此,开展植物内生菌抗肿瘤药物研究就显得尤为重要,同时对天然药物的开发及药用植物的保护有非常重大的意义。Nenkata-chalam等从内生芽孢杆菌JUPR15中提取的生物活性成分B5,该化合物由9-十八碳烯酸、噻吩衍生物和二硝基苯甲酰胺衍生物组成。用B5处理HeLa、HepG2和MCF-7等癌细胞后癌细胞的存活率显著降低,IC50值由6．5变为13．2μg/mL,且对正常外周淋巴细胞无毒。Zhao等研究发现内生枯草芽孢杆菌(B.subtilis)产生的IturinA类脂肽可诱导人异质上皮性结直肠腺癌(Caco2)细胞发生胞吞和凋亡。以上报道表明,植物内生芽孢杆菌可以为抗癌治疗提供具有高治疗价值的前景和可再现的天然产物来源。

3．3　环境修复

传统的环境修复方法价格昂贵,难以处理大规模污染,且对生态系统并不友好。随着内生菌研究的发展,内生菌及植物-内生菌联合修复环境逐渐显露出治理环境的潜力。内生芽孢杆菌在修复重金属污染土壤、降解残留农药和有害化合物、净化有害气体及污水等方面都有报道。

内生芽孢杆菌具有耐受、吸附和解毒重金属的能力,可通过促进宿主植物生长,从而提高植物耐受能力增加植物对重金属的吸收能力。解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)P29能使香蒲的Cd含量和总吸收量显著增加31．1%和63．5%;Cd去除率最高可达79．5%。该菌株促进香蒲生长从而增加香蒲Cd总吸收量,达到去除水中Cd污染的作用,具有应用于水体重金属污染修复的潜力。

芽孢杆菌的降解能力为去除土壤及农作物中的有害物质提供了生物及环境友好型处理方法,这种天然方法不会造成二次污染,且为农药残留、化学残留的处理提供了新的手段。Patel和Kumar分离的内生芽孢杆菌CP1R具有降解2,4-二氯苯酚(2,4-dcp)的能力。宋胜男等研究发现人参内生多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)对田间栽培人参根中5种农药的降解率为66．07%、46．24%、21．05%、72．40%和54．21%。Feng等分离到一种新的能降解难降解有害有机化合物邻苯二甲酸酯(PAEs)的内生芽孢杆菌YJB3,该菌株可以将PAEs分解为邻苯二甲酸单丁酯(MBP)和邻苯二甲酸(PA),直至被完全降解。

Khaksar等研究发现内生蜡样芽孢杆菌(B.cereus)ERBP通过调控IAA和1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)脱氨酶活性减轻甲醛应激介导的影响,从而在甲醛胁迫下刺激蝶豆(ClitoriaTernatea)种子萌发和幼苗生长。这种有利的内生菌-植物联盟在甲醛胁迫下对植物保护和植物修复具有重要价值。

4　总结与展望

植物内生芽孢杆菌作为近年来文献报道较多且未完全开发的微生物资源,在植物中广泛存在,具有生成抗逆芽孢增加定殖存活率的优势,无论在农业生防、医药还是环境修复方面都具有应用潜力。

4．1　植物内生芽孢杆菌多样性的研究方法

在植物内生芽孢杆菌多样性的研究中,传统的分离培养法是研究芽孢杆菌多样性的重要基础,是丰富内生芽孢杆菌资源,研究活细菌进而研究生理学特性不可替代的方法。但这种传统分离培养法无法分离不可培养的细菌,并且在菌株脱离内生态环境后会出现菌种退化或丧失特有生理活性的问题。随着DNA技术的快速发展,包括基于PCR的DNA分析、定量PCR(qPCR)、荧光原位杂交(FISH)、DNA测序和DNA微阵列等更多革命性技术被应用。这些技术可以在不培养细菌的情况下,对微生物群的细菌多样性和群落结构进行定性和定量的分析。该方法可以不依赖于培养技术,但这种非培养法在较精细的分类学水平上缺乏细菌鉴定的精确度。当前,内生芽孢杆菌多样性的研究大多局限于通过传统培养法和手段鉴定细菌种属,其主要侧重于对细菌的生理特性及活性的研究。在未来的研究中,通过高通量、高效率和快速计算的非培养法鉴定内生芽孢杆菌种属并建立独属于植物内生菌的资源库将是研究植物内生芽孢杆菌的有效方法,同时结合培养法研究植物内生芽孢杆菌的多样性将有助于深入开发内生菌资源。

4．2　效应分子及机制研究

植物内生芽孢杆菌及其天然产物具有多种功能,近几年的文献报道主要聚焦于对其促生和抗菌作用、活性代谢产物的纯化及结构鉴定和对植物病原真菌与人畜源致病因子的拮抗机制等方面的研究。其中对促生作用的研究大部分都集中在生长激素、固氮及溶解磷酸盐的能力上,还有部分研究关注在极端环境下芽孢杆菌对植物的促生及抗逆机理。其次对抗菌作用的研究主要集中于直接拮抗机制,包括对抗菌活性天然产物脂肽、抗菌蛋白、细菌素等的鉴定,对植物病原真菌和人源致病菌的抗菌活性评价及机理研究。但是其中对于拮抗机制的研究大多流于表面,主要侧重于对菌体或孢子形态变化、细胞膜完整度、胞内物质渗漏等方面进行表征,对深层次的机理研究较少。

如今对植物内生芽孢杆菌及其天然产物功能作用的研究众多,但是缺乏一定的深度,未来应更加注重深层次研究,例如天然产物的合成基因研究及其异源生物合成、天然抗菌物质对致病菌基因及代谢的影响机制。此外,在极端环境下诱导植物的促生及抗逆、从海洋植物和极端生境植物中发掘内生芽孢杆菌的新型产物和植物内生芽孢杆菌对环境的生物修复都将是未来的研究方向。

4．3　应用及产业化

目前内生芽孢杆菌的产业化主要体现在农业方面,依据内生芽孢杆菌开发的微生物农药除了具有环境相容性,同时具有增产、防治病虫害和提高逆境下存活能力的作用。国内外都曾开发出内生芽孢杆菌制剂,包括活菌制剂和以活性物质为主体的制剂。

在实现应用的过程中,研究者们也遇到了一些难题。首先是防效的稳定性问题。活菌制剂能否稳定定殖并发挥出相应效果是生防制剂能否推广的关键,环境因素(温度,pH值)和生物因素(植物体内微生物竞争)都会使其效果减弱或失效。有报道轮枝镰刀菌(Fusariumverticillioides)产生的镰刀菌酸对莫海威芽孢杆菌(Bacillusmojavensis)等生防制剂具有拮抗作用,会减少活菌制剂定殖的细胞数,降低防效。最新文献报道将生防制剂中的抗菌物质采用合成生物学方法,通过基因工程和分子生物学手段进行结构设计及生物合成,这种方法不仅可以增强其稳定性,还能简化生产工艺,提高产量并降低成本。Lee等通过引入d-氨基酸和脂肪酸设计的d-型脂肽dCopW3明显改善了其盐敏感性和稳定性。

其次还要确保菌株及其产物对人畜安全无害。有研究发现从农作物中分离出的内生蜡样芽孢杆菌(B.cereus)可以产生肠毒素,存在使人腹泻的潜在危害性。此外,活菌制剂类微生物农药更偏向于预防,相比于化学农药具有见效时间长和效果弱的缺陷。目前在农业中应倾向于菌种混合或与化学农药复配施加使用。

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